一、课题来源与背景： 果树种质资源是发展果树生产和开展相关科研工作的基础。目前，番木瓜种质通常以种子保存，但种子实生后代性状易分离。香蕉、荔枝、柑橘和菠萝的种质保存主要通过建立资源圃的方法进行，该方法不仅占地广，管理成本高，而且容易受病虫害及自然灾害影响。因此，需要探索一种适合番木瓜、香蕉、柑橘、荔枝、菠萝种质资源长期稳定的保存方法。课题来源主要有：广东省自然科学基金项目、广东省农业科学院院长基金以及单位自筹资金等。

二、技术原理及性能指标：

(一)技术原理：超低温保存是指在-80℃条件下保存种质的生物学方法（通常称为液氮保存），在液氮温度下的组织和细胞，其生理代谢基本停止，材料变异的可能性最低，采用超低温保存技术进行果树种质资源保存，可以达到长期稳定保存的目的。植物茎尖经过超低温保存后能成活的部位主要位于茎尖分生组织区，这些区域不带病毒或病毒含量低，由该分生区再生成的植株，可能成为脱毒材料。基于此，就可以将超低温保存技术应用于植物病原脱除。
(二)性能指标：

1.首次建立了成年柑橘离体茎尖玻璃化法超低温保存技术：柑橘无菌芽上的茎尖，在MT+0.3 mol/L蔗糖+0.4 mol/L甘油上培养3 d；显微镜下剥取带2～3个叶原基的茎尖，室温下在MT+0.4 mol/L蔗糖+2.0 mol/L甘油装载50 min，在植物玻璃化溶液（PVS2）中处理60 min（0℃）后投入液氮中保存。从液氮中取出材料后放在40℃水浴中解冻，用MT+1.2 mol/L蔗糖洗涤2次，茎尖放在MT+6-BA 1.0 mg/L培养基上先暗培养一周后正常培养，可以实现植株再生。此外，柑橘超低温保存技术可有效脱除HLB、CTV和CEVd阳性材料中的病原，其脱除效率明显高于茎尖微芽嫁接脱毒效率。

2.优化了香蕉离体培养条件，在国内首次建立了香蕉离体茎尖玻璃化法超低温保存技术。将离体培养的茎尖放在MS+0.4 mol/L蔗糖培养基上预培养2 d，显微镜下取带1-2个叶原基的茎尖(1.0～1.5 mm)，25℃下用装载液(MS+2 mol/L Gly+ 0.4 mol/L Suc)处理20～30 min，然后用PVS2（0℃）处理40 min，换一次PVS2后投入液氮中保存。从液氮中取出材料后放在40℃水浴中化冻，用1.2 mol/L蔗糖培养液洗涤，先暗培养10～15 h后再在MS+0.5 mg/L 6-BA的培养基上暗培养1周后正常培养。香蕉茎尖经过超低温保存后成活率为40.0%～75.9%、再生率为35.0%～63.4%。应用建立的超低温保存技术处理香蕉束顶病（BBTV）阳性材料，该技术对BBTV病原脱除率达60.6 %，明显高于常规茎尖脱毒率。

3.优化了番木瓜离体茎尖培养体系，在国内外首次开展番木瓜茎尖玻璃化法超低温保存技术研究。无菌芽上的茎尖在MS+5% DMSO上预培养3d，显微镜下剥取含1～2个叶原基的茎尖，用先60%的 PVS2处理40～50 min，再在0℃条件下用PVS2处理30 min，换一次PVS2后投入液氮中保存24 h。从液氮中取出材料后在40℃水浴中化冻，然后用MS+1.2 mol/L的蔗糖液洗涤2次，经再培养后成活率和再生率分别为53.3%和51.6%。

4.系统地研究了荔枝离体培养和体胚发生条件，首次建立了荔枝胚性悬浮细胞玻璃化法超低温保存技术。

5.建立了高效的菠萝离体茎尖培养体系，在国内首次建立了菠萝茎尖玻璃化法超低温保存技术。
三、技术的创造性与先进性：根据查询国内外相关研究进展，并委托广东省科学技术情报研究所对本研究内容进行查新检索， 结果表明除本项目委托单位及合作单位外，未见其他单位有和以上查新点相同的研究报道。具体如下：
1.建立并优化了柑橘、香蕉、番木瓜等5种果树离体超低温保存技术体系。其中香蕉茎尖玻璃化保存后培养成活率达到40.0%～75.9%、再生率35.0%～63.4%；番木瓜成活率53.3%、再生率51.6%；菠萝成活率达到78.6%～96.5%、再生率达到76.7%～93.2%；荔枝悬浮细胞经超低温保存，相对成活率达到27.1%。
2.离体超低温保存技术体系实现了柑橘、香蕉等果树的脱毒功能。其中，柑橘黄龙病脱除率≥91.6％、衰退病脱毒率≥90.0％、裂皮病脱除率≥88.8％，明显高于茎尖微芽嫁接的脱毒率，并获得了14个柑橘无病原种；香蕉束顶病阳性材料，病原脱除率60.6 %，明显高于茎尖脱毒率。

四、技术的成熟程度、适用范围和安全性：取得的研究结果对果树种质资源保存、植物脱毒和无病苗繁育体系的建设均有借鉴作用，其应用范围主要是果树种质资源保存和病原脱除等。
五、应用情况及存在的问题： 由于不同植物材料对低温敏感程度不一致，操作时需要针对每一种材料摸索其最佳保存条件；此外，利用超低温保存技术脱除植物病原时，并不是所有带病材料经过超低温保存后可以全部脱毒。