| 成果名称: | HSV-2 LAT ORF 的抗凋亡作用及在蛋白水平上的调控机制 |
| 完成单位: | 广州军区广州总医院 |
| 主要人员: | 杨慧兰、樊建勇、孙朝晖、白利利、齐维、薛礼长、张发舟 |
| 介绍: |
生殖器疱疹（GH）主要由单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染所引起，该病毒具有嗜神经性，初次感染机体后可以在骶尾神经内建立终生潜伏感染，极难彻底清除，并可因多种非特异刺激而导致复发感染，潜伏相关转录体是HSV在潜伏感染期间唯一大量存在和可以被检测到的基因组转录产物，被认为在病毒潜伏的建立、维持、再激活等过程中都起着重要的作用，HSV-2 主要LAT由三个开放读码框（ORF1，ORF2，ORF3）构成，LAT潜伏的机制尚不明确，目前主流的观点主要有：LAT蛋白水平的抗凋亡作用和microRNA作用假说。
由于HSV-2 的嗜神经潜伏性，导致其一旦感染就难以完全清除的医学难题。所以新的抗HSV-2 复发药物的研发就势在必行，意义重大。学者们普遍认为HSV LAT 的抗凋亡作用可以让病毒在神经节中处于潜伏状态。如果确定了LAT 上的抗凋亡区域就可以设计药物与其结合干扰其正常的生物活性，而激活病毒，消灭长期潜伏者的病毒，而起到斩草除根的作用。一种生物的外在表现特性都是受基因所支配，所以基因治疗等新的治疗手段也将成为治疗HSV-2 这些嗜神经潜伏性的病毒感染的利器。当然HSV-2 的潜伏感染及再激活机制，牵涉到包括LAT 在内的整个基因组。这些基因相互之间有这千丝万缕的联系，要想彻底搞清楚HSV-2 的潜伏复发机制不能仅仅着眼于LAT 及其ORFs 的抗凋亡作用，要从全局出发，找到攻克这种机制的切入点。
本项目以HSV-2 333标准株基因组为模板，PCR分别扩增主要LAT的三个读码框ORF1,ORF2,ORF3，构建带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-ORF1，pEGFP-ORF2，pEGFP-ORF3，并将重组质粒pEGFP-ORF1，pEGFP-ORF2，pEGFP-ORF3转染SH-SY5Y神经细胞和Vero细胞，实现其在这两种细胞中的表达；构建了放线菌素D，5-氟尿嘧啶，顺铂诱导Vero细胞的凋亡模型；通过Gimesa染色，Hochest33258 荧光染色，MTT，流式细胞术，DNA ladder，caspase-3 活性检测等得出pEGFP-ORF1具有抗放线菌素D，pEGFP-ORF2具有抗5-氟尿嘧啶，pEGFP-ORF3具有抗顺铂诱导的凋亡作用。为进一步阐明LAT在HSV-2潜伏感染中的作用及机制提供了相关的实验依据，为治疗生殖器疱疹及彻底清除机体内的HSV-2病毒提供了一定的理论作用。
本项目1. 成功克隆了HSV-2 潜伏相关转录体各开放读码框基因,首次在国内成功构建了HSV-2 LAT（ORFs）的真核表达载体.并观察其在HSV-2潜伏感染细胞模型中的作用，从蛋白水平探讨了潜伏相关转录体在单纯疱疹病毒的潜伏、复发中的作用，为阐明HSV-2的潜伏与复发机制打下了理论基础。2. HSV-2复制中的重要糖蛋白gD作为靶抗原，首次在我国成功构建了HSP70- DNA疫苗和蛋白疫苗，并利用阳离子脂质体包裹后转染，能在细胞和动物水平诱导较强的特异性细胞免疫，克服了以往疫苗诱导细胞免疫效应弱的缺点，具有较好的临床应用前景。3. 首次利用生物信息学的手段，建立CD8＋T细胞与疱疹病毒表面抗原相互作用的三维模型，在HSV-2全基因组中筛选出多个有价值的免疫短肽，为抗病毒药物的新靶点筛选奠定了坚实的理论基础。
目前该项目共培养博士与硕士研究生3名，主编专著1部，参编1本，在临床皮肤科杂志，病毒学报，微生物学通报、医学研究生学报等核心期刊发表论文30余篇，在Clin Exp Dermatol，Journal of Dermatology Science等SCI收录期刊发表论文４篇，并多次在学术会议上进行大会交流。得到一致好评，对药物长期抑制的系统化治疗有一定的指导意义，取得了很好的临床效果，有很好的学术效益，社会效益和经济效益。
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| 批准登记号: | 粤科成登（2）字【2017】0035 |
| 登记日期: | 2017-01-11 |
| 研究起止时间: | 2010.01 至2012.12 |
| 所属行业: | 卫生和社会工作 |
| 所属高新技术类别: | |
| 评价单位名称: | 国家自然科学基金委员会医学科学部 |
| 评价日期: | 2013.04.26 |
