①课题来源与背景。 课题来源：广东省基础与应用基础研究基金项目，2020A1515010817，外泌体调控难治复发性急性髓性白血病γδ T细胞功能的机制研究，暨南大学 背景：γδ T细胞具有特异性识别抗原功能且不受MHC限制，对于治疗难治复发髓性白血病具有较好的应用前景，但γδ T细胞具有复杂的生物学活性，存在着不同的功能亚群，且疾病状态下的γδ T细胞有着不同程度的功能缺陷。课题组前期研究发现一类与急性髓性白血病（AML）不良预后相关的新型的PD-1high γδ 调节性T细胞（Treg）。关于此类新型γδ Treg亚群的功能和相关调控机制亟待进一步研究。外泌体能够抑制免疫细胞的活性，促进CD4+ CD25high FoxP3+ Treg扩增，与肿瘤的难治复发相关。我们推测白血病细胞来源的外泌体可通过PD-1负性信号通路或表达NKG2D配体来下调γδ T细胞上NKG2D的表达，减弱细胞杀伤作用；外泌体也可能通过TGF-β 等细胞因子以及miR等来上调FoxP3的表达，促进γδ Treg的诱导或转化，抑制肿瘤免疫作用。

    ②研究目的与意义。本研究首先开展了外泌体调控难治复发性AML患者γδ T细胞亚群功能的相关机制研究，通过外泌体中RNA差异表达谱分析寻找潜在的免疫干预新靶点，进一步探讨特异性抗难治复发急性髓性白血病的免疫治疗新策略。

    ③主要论点与论据。 本研究中我们首先采用流式细胞术检测了AML初发、难治复发、缓解期患者及健康人外周血γδ T细胞及其亚群的表达情况，发现与健康对照组比较，AML初发患者总γδ T细胞表达比例呈下降趋势，其中Vδ1+亚群比例增加，Vδ2+亚群比例下降；PD1high γδ T亚群、Foxp3+ γδ T亚群和PD1high Foxp3+ γδ T亚群的表达比例均显著增加。AML初发患者外周血γδ T细胞的PD-1基因表达水平也显著高于健康对照组，颗粒酶和穿孔素基因的表达水平明显降低，且PD-1和Foxp3基因表达水平呈正相关。 AML中PD1high γδ T亚群、Foxp3+ γδ T亚群和PD1high Foxp3+ γδ T亚群的表达比例均为复发组>初发组>缓解组，其中AML复发组的PD1high γδ T亚群比例显著高于初发组和缓解组，AML复发组的PD1high Foxp3+ γδ T亚群比例显著高于缓解组。结合患者临床治疗疗效发现，Foxp3+ γδ T细胞亚群高比例的表达是AML患者获得完全缓解的危险因素。 我们还分析了在不同临床状态AML患者（包括初发、治疗后未缓解（NR）及治疗后完全缓解（CR）的AML病例）外周血中γδ T细胞亚群的T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸基抑制基序域分子（TIGIT）及其竞争性共刺激受体CD226的表达分布特点。结果发现，AML患者外周血γδ T细胞亚群上TIGIT分子和CD226分子的表达分布出现不平衡，新发AML患者的CD226+ γδ T 细胞表达减少，而TIGIT+ γδ T细胞表达增加，而化疗后获得CR的AML患者的TIGIT- CD226+ γδ T 细胞的表达比例得到一定的恢复上升。此外，生存分析的结果显示TIGIT+ CD226- γδ T细胞水平较高的非M3型AML患者的总生存率较低，提示外周血TIGIT+ CD226- γδ T细胞可能是一种新的预后相关的免疫生物标志，其高表达可能与不良预后相关。 我们还分析了TIGIT/共刺激受体DNAX辅助分子1（DNAM-1）轴在不同临床状态AML患者外周血中Foxp3+ γδ Treg亚群的分布和表达情况。在新发和NR患者中，Foxp3+、TIGIT+ Foxp3+和DNAM-1+ Foxp3+ γδ Treg亚群的表达比例显著升高。化疗后达到CR时，Foxp3+、TIGIT+ Foxp3+以及DNAM-1+ Foxp3+ γδ Treg亚群的表达比例下降，患者的免疫功能得到一定的恢复；TIGIT+ Foxp3+ γδ Treg表达比例升高与AML患者总体生存率低相关；且TIGIT+ Foxp3+ γδ Treg高表达是预后的独立危险因素。 采用超速离心法或使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit试剂盒提取外泌体，进行外泌体的鉴定后进行进一步分析。差异性表达的miRNA通过八个数据库预测靶向基因，在至少三个数据库中预测为特定miRNA靶点的基因，进一步获得miRNA和mRNA的互作数据；然后对靶基因进行GO和KEGG基因集富集。从lncRNA和miRNA互作数据，以及miRNA和mRNA互作数据中筛选出高表达和低表达相反的互作基因，借此构建出了在外泌体中的竞争性内源RNA（ceRNA）网络，发现在富集出的基因集中，肿瘤生存相关的通路、血细胞成熟相关通路、T细胞免疫相关通路可能在一定程度上与AML疾病的发生发展相关。 将AML患者来源的血浆外泌体与γδ T细胞共培养，观察共培养前后γδ T细胞对白血病细胞株（KG1-a和NB4）以及白血病耐药细胞株NB4/R1的杀伤效应。结果显示，与外泌体共培养后的γδ T细胞对白血病细胞株KG1-a和NB4以及白血病耐药细胞株NB4/R1的杀伤效应均较共培养前有所增强。

    ④创见与创新。 率先将外泌体引入γδ T细胞亚群功能调控的研究中，探讨外泌体调控难治复发性AML患者γδ T细胞亚群功能的相关机制；率先通过外泌体中RNA差异表达谱分析寻找潜在的免疫干预新靶点，进一步探讨特异性抗难治复发AML的免疫治疗新策略。

    ⑤社会经济效益，存在的问题。 开展外泌体调控AML患者γδ T细胞亚群功能的相关研究，可帮助进一步获得AML免疫治疗新策略，延长患者的生命，提高生存质量，减轻经济负担，具有很好的社会经济效益。在本项目研究平台的支持下，多个研究团队开展了关于γδ T细胞的系列相关研究，发表了相关论文，并获得后续资助。 本项目在一定程度上填补了相应研究领域的空白，但外泌体在AML中的作用和调控机制有待进一步分析，将在后续动物实验研究中继续深入探讨。