课题来源与背景： 广东省科技计划项目 — 农村科技领域：高效表达PEDV受体的用于生产PEDV流行毒株疫苗的细胞株培育（项目编号：2017A020208029，执行期为：2017-01-01至2019-12-31），来源于广东省财政厅的资助，总资助金额为15万。该项目以我国流行广泛、危害严重的猪流行性腹泻为研究对象，针对近年来猪流行性腹泻病毒发生了很大的变异，导致病毒的抗原表位发生变化，使用的CV777株对流行的野毒株的防控能力减弱。另外，PEDV难于适应细胞增殖，是由于目前对PEDV入侵细胞所需受体了解的不是十分清楚，这一科学问题，在已完成的相关研究基础上，构建了稳定表达猪源ACE2的猪小肠上皮细胞系（IPEC-J2），并进行细胞筛选、培养出了适应PEDV高效增殖的易感细胞系，不仅有利于PEDV流行毒株有效分离，更为开发出高效新型PED疫苗奠定了基础。此外，细胞系的获得及临床流行毒株的分离，不仅可提高PEDV的相对产量，而且可以节省成本、提高病毒生产滴度，因此，有望为我市乃至全国猪流行性腹泻病的综合防控提供有利―武器，因而具有很大的市场前景。

    研究目的与意义： 聚焦PEDV适应细胞困难、增殖滴度低，严重阻碍了新型高效疫苗制备这一瓶颈问题，通过对PEDV感染细胞所需受体的筛选和表达，筛选出适合PEDV流行毒株有效分离的细胞株，为PEDV流行毒株新疫苗的研制奠定基础。

    主要论点与论据： 随着对PEDV不断的深入研究，发现PEDV可在表达pAPN的MDCK细胞上生长，但是在不表达pAPN的非洲绿猴肾细胞（Vero）上仍能够很好地生长，因此，推测PEDV可能不只有pAPN这一种受体。另外，不同来源的 Vero 细胞和毒株以及培养条件的差异，对 PEDV 的分离培养也具有一定的影响。而且 Vero 细胞具有干扰素分泌缺陷的特点，不利于PEDV感染 Vero 细胞后先天免疫反应方面的研究。已有研究证实，IPEC-J2细胞系是良好的猪肠上皮模型细胞，与猪的原代小肠上皮细胞具有极强的相似性，而且猪小肠上皮细胞是PEDV体内感染的靶细胞。但是，最新的研究表明，IPEC-J2 细胞是非均质性的细胞，通过间接免疫荧光试验证实，与其他研究者的结果不同，只有极少数的IPEC-J2细胞被PEDV感染。该研究者进一步对IPEC-J2细胞进行极限稀释法的亚克隆，最终获得了均质性的细胞系IPEC-DQ，IPEC-DQ细胞的增殖特性与IPEC-J2细胞相似，IPEC-DQ细胞并未丢失猪肠上皮表型细胞特性，而且PEDV可以高效地感染IPEC-DQ细胞。 血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是一种金属蛋白激酶，在动物的心、肝、肺、肾以及肠道等主要器官中广泛存在。现有研究表明，从SARS-CoV敏感细胞Vero E6细胞中可分离到与SARS-CoV刺突蛋白S1域结合的ACE2；并且证实在SARS-CoV非敏感细胞293T细胞中转染、表达ACE2，则此转染后的293T细胞可被SARS-CoV感染。用ACE2抗体预先处理Vero E6细胞即可阻止SARS-CoV的复制，而ACE1的抗体则不能。因此，认为ACE2是SARS-CoV的受体。

    创见与创新： PEDV与SARS-CoV同属于冠状病毒，因此，本研究在IPEC-J2细胞上稳定表达猪源ACE2，通过潮霉素B筛选，单细胞克隆培养，最终获得IPEC-J2-ACE2细胞系。然后通过荧光定量PCR和Western blot分析ACE2的表达。进而PEDV-WH毒株感染IPEC-J2-ACE2细胞，结果证实，PEDV-WH毒株可以有效感染IPEC-J2-ACE2细胞。本研究为揭示PEDV感染机制奠定了基础，同时为临床PEDV流行毒株新疫苗的研发提供了大规模生产疫苗中的细胞株。

    社会经济效益，存在的问题： 本项目完成的受体表达、细胞筛选、培养出的适应PEDV高效增殖的易感细胞系，不仅有利于PEDV流行毒株有效分离，更为开发出高效新型PED疫苗奠定了基础。此外，细胞系的获得及临床流行毒株的分离，不仅可提高PEDV的相对产量，而且可以节省成本、提高病毒生产滴度，因此，有望为我市乃至全国猪流行性腹泻病的综合防控提供有利―武器，因而具有很大的市场前景。

    历年获奖情况： 目前已在中文核心期刊发表1篇文章，已申请国家发明专利2项，培养副研究员一名。